MICROSPOROGÉNESIS DE TRES ESPECIES DEL SUBGÉNERO PASSIFLORA (PASSIFLORA, PASSIFLORACEAE) DE PARAGUAY

Claudia Pereira Sühsner; Ana I. Honfi; María S. Ferrucci; Norma Deginani

Genética
DOI: dx.doi.org/10.14522/darwiniana.2016.41.680

MICROSPOROGÉNESIS DE TRES ESPECIES DEL SUBGÉNERO PASSIFLORA (PASSIFLORA, PASSIFLORACEAE) DE PARAGUAY

Claudia Pereira Sühsner¹, Ana I. Honfi², María S. Ferrucci³ & Norma Deginani⁴

¹ Laboratorio de Análisis de Recursos Vegetales. Departamento de Biología. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad Nacional de Asunción, Campus Universitario, San Lorenzo, 1039, Central, Paraguay; clauddinha_7@hotmail.com (autor corresponsal).
² Laboratorio de Citogenética Vegetal, Programa de Estudios Florísticos y Genética Vegetal, Instituto de Biología Subtropical (UNaM-CONICET), Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales - Universidad Nacional de Misiones, Rivadavia 2370, 3300, Posadas, Misiones, Argentina.
³ Instituto de Botánica del Nordeste (UNNE-CONICET), Casilla de Correo 209, 3400 Corrientes, Argentina.
⁴ Instituto de Botánica Darwinion (ANCEFN-CONICET), Labardén 200, Casilla de Correo 22, B1642HYD, San Isidro, Buenos Aires, Argentina.
Recibido: 25 de noviembre de 2015. Aceptado: 5 de enero de 2016. Editor Asociado: Amalia Scataglini.

Abstract. Pereira Sühsner C., A. I. Honfi, M. S. Ferrucci & N. Deginani. 2016. Microsporogenesis of three species of subgenus Passiflora (Passiflora, Passifloraceae) from Paraguay. Darwiniana, nueva serie 4(1): 88-90.

The aim of the present study was to characterize karyologically species of Passiflora L. from Félix Pérez Cardozo District, Guairá, Paraguay. The chromosome numbers in meiosis 2n = 9II for P. alata Curtis and P. caerulea L. are reported for the first time. Chromosome number for P. edulis Sims (2n = 9II) is also confirmed. Meiotic behaviour in all studied species was normal with regular chromosome segregation. The most frequent chromosome associations were bivalents at diakinesis and metaphase I. Few meiotic irregularities were observed, such as lagging chromosomes and asynchronous phases of meiosis II, however, pollen viability was high, between 78.83% and 98.6%. The obtained results confirms x = 9 as the basic chromosome number for subgenus Passiflora. The present study is a relevant contribution to the knowledge on the cytogenetics of species of Passiflora subg Passiflora from Paraguay.

Keywords. Meiosis; Passiflora; pollen viability.

Resumen. Pereira Sühsner C., A. I. Honfi, M. S. Ferrucci & N. Deginani. 2016. Microsporogénesis de tres especies del subgénero Passiflora (Passiflora, Passifloraceae) de Paraguay. Darwiniana, nueva serie 4(1): 88-90.

El presente trabajo tuvo por objeto caracterizar cariológicamente las especies del género Passiflora L., subgénero Passiflora, del Distrito Félix Pérez Cardozo, Guairá, Paraguay. Por primera vez, se da a conocer el número cromosómico en meiosis 2n = 9II para P. alata Curtis y P. caerulea L. También, se confirma el número cromosómico de 2n = 9II para P. edulis Sims. El comportamiento meiótico en todas las especies estudiadas fue normal, con segregación regular de los cromosomas. La asociación cromosómica frecuentemente encontrada en diacinesis y metafase I fue de bivalentes. Las pocas irregularidades meióticas observadas consistieron en cromosomas rezagados en anafase I y fases asincrónicas en meiosis II, sin embargo, la viabilidad de polen es alta, entre 78,83% y 98,6%. Los resultados confirman x = 9 como número básico para el subgénero Passiflora. Este estudio es una importante contribución al conocimiento sobre la citogenética de las especies de Passiflora subg Passiflora de Paraguay.

Palabras clave. Meiosis; Passiflora; viabilidad del polen.

INTRODUCCIÓN

El género Passiflora L. es uno de los más importantes de la familia Passifloraceae por comprender más de 500 especies con alto valor económico para la alimentación, la industria farmacéutica y como ornamental. Habita regiones tropicales y se distribuye principalmente en el continente americano (Baillon, 1886; Killip, 1938; Ulmer & MacDougal, 2004).

Aproximadamente el 30% de las especies de Passiflora posee información sobre el número cromosómico (Soares-Scott et al., 2005), se registran especies diploides y poliploides. El número básico de cromosomas para subgéneros y diversos grupos de especies aún resulta controversial. Storey (1950), basándose en estudios realizados en diferentes especies, híbridos interespecíficos y razas poliploides de Passiflora, propuso como número básico x = 3 ó 6 para el género. Otros autores definen como número básico para Passiflora x = 12, en lugar de x = 6, este último es considerado exclusivo del subgénero Delacoba (DC.) Rchb., y es calificado como una autapomorfía del subgénero (De Melo & Guerra, 2003).

Hansen et al. (2006) relacionaron los clados de Passiflora con el número cromosómico de las especies que los integran, y caracterizaron con el número haploide a los subgéneros Delacoba x = 6, Passiflora x = 9 y x = 12 para Astrophea (DC.) Mast. y Deidamioides (Harms) Killip. En general, las especies conocidas cromosómicamente pueden agruparse sobre la base del número gamético de cromosomas (n) en tres grupos, reuniendo subgéneros y especies de la siguiente manera: i) n = 6, 12, 18; ii) n = 10 y iii) n = 9, 36 (De Melo et al., 2001). Estos autores reúnen en el primer grupo citológico, a especies diploides (2n = 12), tetraploides (2n = 24) y hexaploides (2n = 36) con similaridades cariológicas, tales como cariotipos formados por cromosomas metacéntricos y submetacéntricos y núcleo interfásico de tipo areticulado (subg. Astephia Killip, Astrophea, Plectostemma Mast., Pseudomurucuja (Harms) Killip y Psilanthus (DC.) Killip). El segundo grupo reúne 20 especies diploides con 2n = 18 y n = 9II junto a un raro registro de 2n = 72 cromosomas, cuyos rasgos comunes son el tamaño cromosómico y núcleos de interfase de tipo semireticulado (subg. Calopathanthus (Harms) Killip, Distephana (Juss.) Killip, Granadillastrum Triana & Planc., Passiflora, Tacsonia (Juss.) Triana & Planc. y Tacsonioides (DC.) Killip). Finalmente en la última categoría, se ubica una sola especie (subg. Dysosmia (DC.) Killip) que posee 2n = 20 pequeños cromosomas, formación de 10 II en meiosis y el núcleo de interfase de tipo areticulado.

Los estudios del género en Paraguay son escasos, constituyendo principalmente estudios de la flora regional, estudios florísticos, o de plantas medicinales (Sandoya, 1994; Céspedes et al., 2008; Pin et al., 2009; Pereira et al., 2009). El informe del Conservatoire et Jardin Botaniques, Ville de Genève (Suiza) y Missouri Botanical Garden, Saint-Louis, MO (USA), elaborado por R. Spichiger & N. Rasolofo (2002), estima que existen 18 especies de Passiflora distribuidas ampliamente por el territorio paraguayo, mientras que en el Catálogo de la Flora del Cono Sur (Zuloaga et al., 2008) se mencionan 23 especies.

El presente trabajo tiene como objetivo analizar la meiosis y la viabilidad del polen de las especies del subgénero Passiflora del género Passiflora L., procedentes del Distrito Félix Pérez Cardozo, Departamento Guairá, Paraguay.

MATERIALES Y MÉTODOS

Las especies estudiadas (Passiflora alata Curtis, P. caerulea L., P. edulis Sims) han sido coleccionadas en el distrito Félix Pérez Cardozo, Dpto. Guairá, Paraguay. Se coleccionaron un total de 46 ejemplares del género, cuyos ejemplares de herbario se depositaron en el Herbario de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad Nacional de Asunción (FaCEN – UNA) ( Tabla 1 Tabla 1. Lista de especies de Passilora estudiadas, de Paraguay, Depto. IV. Municipio Félix Pérez Cardozo; datos de colección y georreferencias. ).

Para la identificación taxonómica de las especies fueron utilizados los criterios de Killip (1938) y Deginani (1999; 2001). A los fines de elaborar una base de datos citogenéticos útil de las especies de Passiflora, también se constataron las sinonimias.

Para estudiar la microsporogénesis, se obtuvieron anteras inmaduras a partir de botones florales jóvenes fijados directamente en el campo durante las colecciones botánicas. La fijación del material, se realizó con etanol absoluto: ácido láctico glacial en proporción 5:1 (Fernández, 1973). A fin de observar las células madre del polen (CMP), se realizó una incisión transversal de la antera y luego se maceró suavemente en una gota de carmín acético al 2%. Posteriormente se aplastó el material y se observó al microscopio óptico. Los preparados con CMP se hicieron permanentes con solución de Terpentina de Venecia, para ello se agregó una gota de dicha solución en uno de los bordes del cubreobjeto y se facilitó su difusión colocando en el lado opuesto un triángulo de papel de filtro para absorber el colorante. Se dejó secar el medio de montaje al menos por 72 horas.

Los estudios de viabilidad del polen se realizaron con la técnica de carmín: glicerina (1:1), se dejó actuar el colorante durante 48 horas y se determinó el porcentaje de granos de polen teñidos sobre un mínimo de 1000. La clasificación del tamaño del grano de polen se basó en el eje de mayor longitud (eje polar o diámetro ecuatorial), de acuerdo al criterio de Erdtman (1966): <10 µm muy pequeño, 10 a 25 µm pequeño, 25 a 50 µm mediano, 50 a 100 µm grande, 100 a 200 µm muy grande, >200 µm gigante.

Las fotomicrografías fueron tomadas con cámara digital MOTICAM (2006), incorporada al microscopio óptico marca OLYMPUS serie CX31 con ocular de 100x.

RESULTADOS

Passiflora alata Curtis.

Se analizó el comportamiento meiótico de una procedencia de esta especie y se encontró que el nucléolo es persistente hasta metafase I y la única asociación cromosómica encontrada en diacinesis y metafase I han sido 9II en todas las CMP analizadas ( Fig. 1A Fig. 1. Microsporogénesis de Passilora alata. A, CMP en diplotene con 9II. B, Grano de polen coloreado, viable. C, Grano de polen no coloreado, no viable. ). La meiosis tiene un comportamiento regular y concluye con la formación de cuatro microsporas que darán origen a cuatro granos de polen (n). La viabilidad del polen ha sido 98,6 %, los granos inviables son ligeramente más pequeños que los viables (Figs. 1B-C, Tabla 2). Se observaron dos tipos de granos inviables, vacíos y colapsados en promedio de 0,8 % y 0,6 % respectivamente.

Passiflora caerulea L.

Se analizaron 19 procedencias de esta especie y en todas se encontraron 2n= 9II. (Tabla 1). La única asociación cromosómica encontrada en diacinesis y metafase I ha sido 9II ( Fig. 2A ). El comportamiento meiótico ha sido regular en todas las procedencias analizadas (Fig. 2B-C, F). La mayoría de las CMP en anafase I presentan comportamiento cromosómico regular durante la segregación. Ocasionalmente se observaron comportamientos meióticos inusuales, como la presencia de uno o dos pares de cromosomas rezagados (Fig. 2D-E). La presencia de cromosomas rezagados ha sido frecuentemente observada en anafase II. La disposición y orientación de los husos acromáticos durante la meiosis II fue generalmente perpendicular (Fig. 2D) y rara vez se observaron paralelos (Fig. 2E). En algunas CMP en metafase II y anafase II se observó comportamiento asincrónico de los cromosomas, es decir, que los conjuntos cromosómicos de cada huso acromático se encontraban en distintas etapas de la migración. Se observaron cuatro microsporas como producto meiótico (Fig. 2H), ocasionalmente se observa una o dos microsporas con dos o tres nucléolos por núcleo (Fig. 2I). La meiosis concluye con la formación de cuatro microsporas genéticamente reducidas (n) (Fig. 2G). La viabilidad del polen en promedio ha sido 84,61 %, los granos inviables son ligeramente más pequeños que los viables (Figs. 2J-K,

Tabla 2 Tabla 2. Viabilidad de polen para las especies de Passilora estudiadas. ). Se observaron dos tipos de granos inviables, vacíos y colapsados con porcentaje promedio de 7,05 % y 8,34 % respectivamente.

Por otro lado, una de las accesiones de P. caerulea (Pe39), presentó una meiosis regular ( Fig. 3A-B Fig. 3. Microsporogénesis de P. caerulea L. (Pe39). A, CMP en profase temprana. B, Microspora con n = 9. Un cromosoma ausente en otro plano. C, Políadas con microsporas libres. D, E, Tétrade con cuatro microsporas. F, Políada
con seis microsporas. G, Políadas con ocho microsporas. H, Políada con doce microsporas. La barra indica 10 µm. ) y como resultado post-meiótico políadas con microsporas libres, o tétradas o políadas con seis, ocho, diez o doce microsporas (Figs. 3C-H), que probablemente resultan de divisiones mitóticas subsiguientes a la formación de la tétrade de microsporas, cromosómicamente reducidas (n). Dichas políadas están formadas por microsporas (n) y todas rodeadas por calosa (Figs. 3C-H). Los granos de polen son de tamaño mediano, cuyo eje polar oscila entre 25 µm y 50 µm. La viabilidad del polen para esta accesión (Pe39) fue 52,76 %, y el 47,24 % restante refiere a polen inviable y de tamaño diverso.

Passiflora edulis Sims

Se analizaron 2 procedencias de esta especie y en ambos casos se encontraron 2n = 9II. En diplotene, diacinesis y metafase I se encontraron 9II en todas las células analizadas (Figs. 4A-B). La mayoría de las CMP presentaron comportamiento cromosómico regular durante la segunda división meiótica ( Fig. 4C Fig. 4. Microsporogénesis de P. caerulea L. (Pe39). A, CMP en profase temprana. B, Microspora con n = 9. Un cromosoma ausente en otro plano. C, Políadas con microsporas libres. D, E, Tétrade con cuatro microsporas. F, Políada
con seis microsporas. G, Políadas con ocho microsporas. H, Políada con doce microsporas. La barra indica 10 µm. ). La orientación del huso en la anafase II fue generalmente perpendicular (Fig. 4D), rara vez en paralelo (Fig. 4E). Se observaron tétradas con cuatro microsporas como producto meiótico (Fig. 4F). El promedio de granos de polen viables fue 96,30 % (Figs. 4G- I; Tabla 2).

DISCUSIÓN

Hansen et al. (2006) relacionó el número básico de cromosomas con los cuatro subgéneros: Astrophea, Deidamioides, Delacoba y Passiflora (Feuillet & MacDougal, 2003). Las tres especies aquí analizadas corresponden al subgénero Passiflora, que se caracteriza por reunir especies con x = 9.

Se menciona por primera vez el comportamiento meiótico con n = 9II para P. caerulea y P. alata; no obstante, Heitz (1926), Nakajima (1931), Simonet & Miedzyrzecki (1932), Bowden (1940, 1945), De Melo (2001) y Chiapero et al. (2013) reportaron para P. caerulea 2n = 18. De igual manera, para P. alata Storey (1950), Guerra (1986), De Melo (2001, 2003) y Sorza (2003) observaron 2n = 18. El número cromosómico hallado en meiosis de P. edulis 2n = 9II, coincide con la cita de Gill et al. (1984) y con los reportes de Janaki Ammal (1945), Storey (1950) y Guerra (1986) quienes encontraron 2n = 18 cromosomas en mitosis.

Todas las especies resultaron diploides con comportamiento regular durante la microsporogénesis y forman granos de polen viables. Estos resultados coinciden con las observaciones de varios autores (De Melo et al., 2001; Souza, 2002; Souza et al., 2003), quienes estudiaron la meiosis de otras especies diploides y donde la asociación cromosómica más frecuentemente observada fueron bivalentes. Diversos trabajos reportaron irregularidades durante la meiosis, como la presencia de univalentes, cromosomas rezagados, fases asincrónicas, puentes anafásicos, micronúcleos, citocinesis aberrante y microcitos, apareamiento de cromosomas de tamaños diferentes, asociaciones secundarias de los cromosomas en metafase I, diferentes posiciones del huso acromático formando distintos patrones de tétradas y degeneramiento citoplasmático (Barbosa & Vieira, 1997a; Olaya, 2002; Souza et al., 2003). Sin embargo, en las especies analizadas el comportamiento fue regular durante la segregación cromosómica en anafase I, y concuerda con lo reportado por Barbosa & Viera (1997a, b), De Melo et al. (2001) y Souza (2002).

La viabilidad del polen está relacionada con el comportamiento meiótico o eventos post-meióticos (Barrios, 2005; Souza et al., 2008). Ferreira (1994) considera que las especies de Passiflora con 2n = 18 presentan una meiosis regular y alta fertilidad, consideración que concuerda con las especies analizadas aquí, que presentaron una viabilidad del polen cuyo rango varía entre 78,83% y 98,6%.

La formación de políadas en una de las accesiones de P. caerulea resulta un dato novedoso en la especie pero ya fueron encontradas en el género. La presencia de esporadas diferentes a tétrades de microsporas, resultantes de la meiosis ha sido observada en P. amethystina Mikan, P. cincinnata Mast., P. edulis Sims., P. gibertii N. E. Brown, P. kermesina Link & Otto, P. malacophylla Mast., P. mucronata Lam., todas con 2n = 18 cromosomas, P. rubra L. (2 n = 12), P. pentagona Mast. y P. suberosa L. (2 n = 24) (Souza y Santana Pereira, 2011), sin embargo fueron entendidas como resultantes de anomalías en la disposición del huso acromático en meiosis II.

Una de las explicaciones posibles para el origen de las políadas de la accesión P39 podría considerar que en lugar de tétradas de microsporas, se formaron otras esporadas con mayor número de células, sin embargo, no se observaron indicios de comportamiento meiótico irregular que sustenten esta hipótesis. Más probablemente, se trata de un proceso donde las tétradas de cuatro microsporas formadas por meiosis permanecen rodeadas por calosa mientras se dividen por mitosis sucesivas dando lugar a la políada. Además, las políadas observadas en Pe 39, sugieren que las mitosis post-meiosis no ocurren simultáneamente en todas las microsporas, y por esa razón las mismas contienen 6, 8, 10 o 12 microsporas de diverso tamaño. Cada microspora forma un grano de polen de diferente tamaño explicando la heterogeneidad observada en el tamaño del polen.

CONCLUSIONES

El presente trabajo constituyó el primer estudio citológico para las especies de Passiflora subgénero Passiflora del distrito Pérez Cardozo de Paraguay. Los resultados obtenidos confirman x = 9 como número básico para el subgénero y constituyen un importante aporte al conocimiento sobre la distribución, taxonomía y evolución de las especies de Passiflora, así como también son de utilidad para el mejoramiento genético, la conservación y manejo de estos recursos genéticos de interés alimenticio y ornamental.

INTRODUCCIÓN
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES

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